肿瘤转移抑制因子CD82/KAI1与神经节苷脂协同抑制肿瘤转移分子机制的研究

【摘要】CD82/KAI1是四跨膜蛋白家族（tetraspaninsuperfamily）的重要成员之。其主要生物学功能是参与细胞运动、迁移的调节。CD82广泛表达于各种正常的组织细胞，在肿瘤组织表达降低或不表达。最初研究发现CD82是前列腺癌特异的转移抑制因子。后来大量的实验结果表明，在各种不同组织来源的肿瘤，CD82均可抑制其细胞的转移。CD82可抑制体外培养的肿瘤细胞的运动迁移能力，抑制动物模型瘤细胞的转移，临床上多种肿瘤的恶性程度及转移能力（尤其是淋巴结转移能力）与CD82蛋白的表达成负相关，检测CD82蛋白的表达可做为判断肿瘤是否转移及预后的重要指标。因此，CD82被认为是广谱的肿瘤转移抑制因子（wide-spectruminvasion-andmetastasis-suppressor）。自从1995年CD82的肿瘤转移抑制能力被首次报道以来,对其作用机制进行了不断的探索，其抑制肿瘤转移的机制正逐步被揭示。CD82抑制肿瘤细胞的转移主要通过两条途经来实现。是直接与些细胞表面黏附分子如整合素（integrin）、膜结合型免疫球蛋白（mIgG）等相互作用，影响细胞的浸润及运动迁移能力。二是直接或间接作用于些细胞质膜受体如生长因子受体等，影响其介导的信号跨膜传递，从而调节细胞内与运动迁移相关的信号通路。神经节苷脂是分布于各种组织细胞表面的含有唾液酸的鞘糖脂。神经节苷脂主要通过将疏水的神经酰胺部分插入脂质双分子层的质膜外层而定位于细胞膜上，其寡糖部分则暴露于细胞表面。神经节苷脂虽属于细胞质膜的微量组份，但它能够与细胞膜上的其它组分如黏附分子、受体等相互作用，参与细胞识别黏附，调节受体介导的信号跨膜传递从而调节细胞分化及运动迁移能力等。近年来的研究发现，CD82的转移抑制作用与神经节苷脂，尤其是GM2和GM3的关系十分密切。大量的研究表明，CD82与神经节苷脂对多种组织来源的肿瘤转移有协同抑制作用。如GM3与CD9对肿瘤转移可发挥协同抑制作用。GM2与CD82对肿瘤转移的抑制能力远大于二者的单独作用。GM2和GM3共同与CD82可发挥最大的协同抑制效应。目前，对CD82与神经节苷脂协同作用机理知之甚少。研究发现，在细胞表面，CD82常与神经节苷脂或其它四跨膜家族蛋白簇集分布在特定功能的膜微区，并募集些膜分子如生长因子受体、整合蛋白、肌醇3激酶、PKC等形成特定功能的膜蛋白复合体（TetraspaninWeb）。CD82抑制肿瘤转移的作用有赖于TetraspaninWeb的形成。抑制TetraspaninWeb的形成，CD82失去转移抑制的作用。因此，弄清楚CD82与神经节苷脂协同作用机理，以及TetraspaninWeb形成机制，对最终彻底阐明CD82抑制肿瘤转移分子机理是十分重要的。弄清这问题，首先要了解CD82与神经节苷脂以及其他组成TetraspaninWeb分子之间相互识别、相互作用的分子结构基础。CD82是跨膜糖蛋白，其胞外区有三个可N-糖基化的位点（Asn129,Asn157和Asn198）。将这些糖基化位点定点突变后，CD82抑制肿瘤转移作用减弱或消失。提示N-糖链对CD82发挥抑制肿瘤转移作用是必需的。已知糖链的重要作用之是参与蛋白质-蛋白质、蛋白质-鞘糖脂之间的识别、粘连。因此，N-糖链可能做为CD82与神经节苷脂及其他分子相互作用的重要结构。在本课题研究工作中，为探讨神经节苷脂与CD82协同抑制肿瘤转移的分子机理，我们进行了以下几个内容的研究。一．神经节苷脂GM2/GM3对肿瘤细胞体外运动迁移能力的影响及可能作用机理的研究。采用不同淋巴结转移能力的小鼠腹水型肝癌细胞株做为模型（淋巴结高转移肝癌细胞株HCa-F和低转移株HCa-P），比较了两细胞株神经节苷脂的表达。我们发现两细胞株神经节苷脂组份有显著的差异：低转移的Hca－F细胞神经节苷脂以较简单的GM3为主（约占80%）。而高转移的Hca－P细胞神经节苷脂以GM2为主（约占70%），并含有较多的结构较复杂的神经节苷脂GM1、GD1等。提示神经节苷脂的差异性表达可能牵涉到两细胞株淋巴节转移的能力。为此，我们对GM3影响两细胞株淋巴节转移能力的分子机制做了进步的研究。我们用特异的神经节苷脂合成抑制剂（PPPP）处理低转移的Hca－P细胞，下调Hca－P细胞GM3的表达；同时用外源性GM3处理高转移的Hca－F细胞，以上调Hca－F细胞GM3的表达，然后采用Boyden小室培养和Westernbloting技术，分别观察了GM3对两细胞株表皮生长因子受体（EGFR）的磷酸化活化、细胞内与转移相关的PI3K/AKT信号转导通路的活性，以及两细胞株细胞的体外迁移能力的影响。结果：（1）神经节苷脂合成抑制剂（PPPP）下调低转移的Hca－P细胞神经节苷脂的合成（下调GM3的表达），可促进细胞体外运动迁移；但同样下调高转移的Hca－F细胞神经节苷脂的合成（下调GM2的表达），则不影响其体外运动迁移。说明是GM3而不是GM2可影响细胞体外运动迁移，GM3的作用是抑制细胞的运动迁移。（2）下调低转移的Hca－P细胞神经节苷脂的合成（下调GM3的表达），可促进EGFR的1173酪氨酸残基磷酸化及PKB/Akt的丝氨酸473、苏氨酸308残基磷酸化；增加外源性GM3，上调高转移的Hca－F细胞GM3含量，可抑制EGFR的1173酪氨酸残基磷酸化及PKB/Akt的丝氨酸473、苏氨酸308残基磷酸化，说明GM3可抑制EGFR的活化，下调PI3K信号转导通路。这可能是GM3抑制细胞的运动迁移的机制之。（3）采用PI3K信号转导通路的抑制剂阻断PI3K信号转导通路，可抑制细胞的迁移运动能力。说明PI3K信号转导通路是调节细胞迁移运动能力的细胞内主要信号转导通路。结论：（1）GM3是影响两细胞株细胞淋巴结转移能力的重要因素之，其作用是抑制淋巴结转移。（2）GM3抑制淋巴结转移的可能分子机制之是抑制EGFR自身磷酸化活化，下调细胞内PI3K/AKT信号通路转导通路活性。二．神经节苷脂与CD82协同抑制肿瘤转移的分子机理的研究。我们采用人淋巴结高转移结肠癌SW620细胞株为模型，对神经节苷脂与CD82协同抑制肿瘤转移的分子机理进行了研究。SW620细胞株几乎无CD82表达，GM2是其主要神经节苷脂组分。我们采用神经节苷脂合成抑制剂（PPPP）或添加外源性神经节苷脂以改变神经节苷脂含量，或采用分子生物学技术转染CD82基因使其过表达，然后采用Boyden小室培养和Westernbloting技术，分别观察了GM3和CD82不同处理条件下SW620细胞体外迁移能力、表皮生长因子受体（EGFR）的磷酸化活化、细胞内与转移相关的信号转导通路PI3K/AKT、MAPK和PLCγ信号转导通路活性影响。结果：（1）GM3抑制EGFR刺激的SW620细胞体外迁移运动，同时抑制EGFR的酪氨酸1173残基和PKB/Akt的丝氨酸473残基磷酸化；GM2对细胞迁移、EGFR和PKB/Akt磷酸化均无影响。（2）CD82过表达抑制EGFR刺激的SW620细胞体外的迁移运动，同时抑制EGFR的酪氨酸1045残基和ERK的磷酸化。（3）GM3和GM2均可增强CD82对SW620细胞体外迁移运动的抑制作用，但GM3增强CD82对EGFR酪氨酸残基1173和Akt磷酸化的抑制作用，GM2增强CD82对EGFR酪氨酸残基1045和Erk磷酸化的抑制作用。（4）GM3和GM2共同与CD82作用可对细胞迁移产生最大的协同抑制效应，同时抑制EGFR的1173酪氨酸残基、1045位酪氨酸残基磷酸化，和Akt、Erk的磷酸化。说明GM3和GM2与CD82产生最大协同抑制效应可能是同时抑制EGFR的1173酪氨酸残基、1045位酪氨酸残基磷酸化，同时下调细胞内和MAPK信号转导通路活性的结果。结论：（1）GM3单独可抑制EGFR刺激的SW620细胞体外迁移运动，其原理是抑制EGFR的酪氨酸1173残基磷酸化及活化，下调细胞内PI3K/AktK信号转导通路，而GM2则无作用。（2）CD82单独也可抑制EGFR刺激的SW620细胞体外迁移运动，但其原理是抑制EGFR的酪氨酸1045残基磷酸化及活化，下调细胞内MAPK信号转导通路。（3）GM3和GM2单独均可与CD82产生协同抑制作用，但机理不同。GM3与CD82协同抑制机理是增强对EGFR酪氨酸残基1173残基磷酸化的抑制和下调细胞内PI3K/AktK信号转导通路。GM2与CD82协同抑制机理是增强对EGFR酪氨酸残基1045残基磷酸化的抑制和下调细胞内MAPK信号转导通路。说明GM3和GM2分别通过不同的机制与CD82发挥协同作用。（4）GM3和GM2共同与CD82作用可对细胞迁移产生最大协同抑制效应，其原理是同时抑制EGFR的1173酪氨酸残基、1045位酪氨酸残基磷酸化，同时下调细胞内和MAPK信号转导通路活性。三．CD82N-糖链在神经节苷脂与CD82协同抑制转移中的作用及分子机理的研究。已知细胞表面糖脂及糖蛋白的聚糖糖链的重要作用之是参与蛋白质-蛋白质、蛋白质-鞘糖脂之间的识别、粘连。为弄清CD82胞外结构N-糖链在CD82与神经节苷脂协同抑制肿瘤转移中的作用，我们采用基因重组技术构建了携带CD82cDNA的重组质粒pcDNA4.0-CD82-V5。以此为模型，采用点突变技术构建了不同N-糖基化位点突变的CD82重组质粒，将其用脂质体转染技术转染SW620细胞，观察不同N-糖基化位点突变的CD82表达产物在细胞亚器的分布，及对细胞体外运动迁移能力的影响。并筛选了稳定表达不同突变体的细胞株，对部分突变体在细胞表面脂筏中的分布进行了初步的研究。结果：（1）构建了携带CD82cDNA的重组质粒pcDNA4/V5-CD82以及不同N-糖基化位点突变的CD82重组质粒，包括Asn129、Asn157、Asn198单位点突，Asn129/Asn157、Asn129/Asn198、Asn157/Asn198双点突变和Asn129/Asn157/Asn198三点突变的CD82突变体，基因测序证明构建成功。（2）细胞组化实验结果表明，不同N-糖基化位点突变的CD82突变体在SW620成功表达。除双点突变Asn157/Asn198和三点突变的Asn129/Asn157/Asn198的CD82分布在胞内，其余突变体均在细胞表面表达。（3）Asn129/Asn157、Asn157/Asn198、Asn129/Asn157/Asn198位点突变可影响CD82对肿瘤细胞体外迁移的抑制作用。（4）筛选了稳定表达Asn129/Asn157/Asn198突变体的细胞株，采用超速离心技术分离细胞膜脂筏，观察不同N-糖基化位点突变对CD82在脂筏分布的影响。结论：（1）成功构建了不同N-糖基化位点突变的CD82重组质粒。（2）不同N-糖基化位点突变的CD82突变体在SW620可成功表达。（3）Asn129/Asn157、Asn157/Asn198、Asn129/Asn157/Asn198N-糖基化位点可能与CD82肿瘤转移抑制作用有关。（4）Asn157/Asn198、Asn129/Asn157/Asn198N-糖基化位点可能是通过影响CD82在细胞膜脂筏中的分布，从而影响CD82的肿瘤转移抑制作用。
【作者】黄晓华；
【导师】马克里；
【作者基本信息】大连医科大学，生物化学与分子生物学，2014，博士
【关键词】CD82；GM3；metastasis；EGFR；N-glycosylation；

【参考文献】
[1]王跃.基于汉语协同发音模型的文本驱动三维口型动画合成研究[D].山东财经大学,计算机应用技术,2014,硕士.
[2].2013年我省获国家科学技术奖项目(为主完成)[J].今日科技,2014,01:18.
[3]史文虎.旅游房地产营销模式研究[D].西南财经大学,2003.
[4]郭丽娟.茄子种间杂交创建的雄性不育系及保持系生理生化特性研究[D].河北农业大学,蔬菜学,2004,硕士.
[5]王远鹏.吉林省游泳俱乐部开展状况与对策研究[D].东北师范大学,体育人文社会学,2012,硕士.
[6]李堃.改性丝素蛋白的结构及其机理的研究[D].东华大学,2014.
[7]王毅.江汉平原农户休闲活动时空间结构研究[D].华中师范大学,人文地理学,2014,硕士.
[8]张智源.高速摆动条件下编织材料摩擦学性能与摩擦热耦合作用机制[D].河南科技大学,材料加工工程,2013,硕士.
[9]刘子铭.siRNA靶向抑制肝素生物合成酶NDST-2以揭示肝素在肥大细胞中的天然活性[D].山东大学,微生物与生化药学,2013,硕士.
[10]殷步九.一种专业化、规范化、面向设计者的办公自动化及专业排版新工具——四通易排全能排版系统[J].云南印刷.1995(05)
[11]朱冰春.烟酸的绿色合成与催化剂研究[D].浙江工业大学,工业催化,2004,硕士.
[12]陈沧杨.计及系统可靠性与收益风险的峰谷分时电价模型研究[D].重庆大学,电气工程,2014,硕士.
[13]马赟.活血化瘀通络中药对糖尿病大鼠肾脏的保护作用及其对血管内皮生长因子的影响[D].河北医科大学,中西医结合临床,2013,硕士.
[14]李梅.网络监督与司法审判研究[D].河北师范大学,马克思主义基本原理,2012,硕士.
[15]刘致远.基于Tilera多核处理器的JPEG XR图像编码软件设计[D].浙江大学,电子信息技术及仪器,2013,硕士.
[16]熊梦云.基于吸收合并下盈余管理与并购管理能力的实证研究[D].广东工业大学,会计学,2014,硕士.
[17]朱韬析,王超,张雪松,项中明.浅析空载投入换流变压器对直流输电系统的影响[J].电力系统自动化,2007,23:108-112.
[18]林铲.论我国当前食品安全监管缺陷及其法律完善[D].华侨大学,法律,2013,硕士.
[19]张金江,郭创新,曹一家,易永辉,唐跃中,徐立中,刘波,杨健.基于MAS的变电站信息一体化嵌入式平台设计[J].电力系统自动化,2008,09:52-56.
[20]任伟.Invar合金的CMT表面毛化及其与纯铝的压焊连接机理研究[D].哈尔滨工业大学,材料加工工程,2014,硕士.
[21]刘世清.反思与重构：教育交往中的言语问题研究[D].安徽师范大学,教育学原理,2004,硕士.
[22]高为炳.机器人班组的自组织递阶控制[J].自动化学报,1994,03:257-264.
[23]李鹏飞.Mg和稀土元素对Al-20%Si合金组织与力学性能研究[D].兰州理工大学,材料加工工程,2014,硕士.
[24]张英.呼包鄂区域一体化对土地利用需求的分析[D].内蒙古师范大学,土地资源管理学,2012,硕士.
[25]张瑜.复发性急性胰腺炎致病高危因素及预后分析[D].山西医科大学,外科学（专业学位）,2013,硕士.
[26]陈大泉.我国电信设备制造企业客户关系管理应用研究[D].天津大学,工商企业管理,2013,硕士.
[27]刘雨丰.猪圆环病毒2型Cap蛋白主要抗原表位重组复制缺陷型腺病毒的黏膜免疫效果评价[D].河南农业大学,预防兽医学,2012,硕士.
[28]秦军瑞,陈书明,张超,陈建军,梁斌,刘必慰.A-Z-A型石墨烯场效应晶体管吸附效应的第一性原理研究[J].物理学报,2012,02:192-200.
[29]黄天生.A电厂人才流失的原因与对策研究[D].华南理工大学,高级管理人员工商管理（专业学位）,2013,硕士.
[30]柳洪鹃.甘薯不同品种块根产量差异的光合产物卸载机制及钾肥调控效应[D].山东农业大学,作物栽培学与耕作学,2014,博士.
[31]易灿南.比较安全学构建及其应用实践研究[D].中南大学,安全技术及工程,2014,博士.
[32]何竹轩.长沙移动公司绩效管理体系改进研究[D].湖南大学,企业管理,2013,硕士.
[33]王嘹亮,梁德华,钟和贤,王群,曾繁彩.麦哲伦海山区富钴结壳成矿条件分析[J].南海地质研究.2001(00)
[34]杨旭.材料在服装设计中的艺术表现[D].天津工业大学,服装设计与工程,2004,硕士.
[35]董爱美,王士同.共享隐空间迁移SVM[J].自动化学报,2014,10:2276-2287.
[36]杜仁骞.球状脂联素的制备及其对Ⅰ型糖尿病的治疗作用[D].复旦大学,生物化学与分子生物学,2010,硕士.
[37]梁瑜,贾利民,蔡国强,刘金朝.滚动轴承的非线性动力学故障模型研究[J].中国铁道科学,2014,01:98-104.
[38]蒋良孝.一种数据挖掘查询语言DMQL[J].微机发展,2003,07:15-16.
[39]刘蒋茵.弗洛姆的意识形态理论与群体意识形态关联性[D].华中师范大学,国外马克思主义研究,2014,硕士.
[40]黄金伟.碳青霉烯类耐药斯坦利沙门菌的发现及其耐药机制研究[D].复旦大学,病原生物学,2013,博士.
[41]刘金海.钻井OPC一体化仪表系统的研究与开发[D].重庆大学,机械制造及其自动化,2014,硕士.
[42]吴成霞.天津市工业能耗预测与节能评价研究[D].天津理工大学,管理科学与工程,2013,硕士.
[43]陈义标.曝气生物滤池对染料废水的深度处理研究[D].东华大学,环境工程,2004,硕士.
[44]胡安.开放进程中的中国证券市场外部因素影响初探[D].清华大学,数量经济学,2003,硕士.
[45]黄秋兰.冗余灵巧臂的运动规划及其优化[D].浙江大学,控制理论与控制工程,2013,硕士.
[46]李忠.PSR对甘蔗品质和某些生理生化特性的影响[D].广西大学,作物栽培学与耕作学,2004,硕士.
[47]侯晓丽,胥布工.不确定多时滞系统的自适应控制[J].控制与决策,2007,07:813-816.
[48]王栋.生物反应器内应用富血小板血浆构建血管化复合体修复骨坏死的研究[D].山东大学,外科学（专业学位）,2014,博士.
[49]蒋志勇.日志管理系统研究及其在OSCAR中的实现[D].浙江大学,2004.
[50]曹丽娇.确认不侵犯知识产权诉讼研究[D].西南政法大学,知识产权法学,2012,硕士.